前敌委员会的秘密指挥所设在女子职业学校，而起义的总指挥部则设在江西大旅社。这是一栋灰色的五层大楼，落在繁华的中山路和胜利路交叉处的洗马池，建成于1924年，是当时南昌城的“地标”，共96个房间。7月下旬贺龙带领部队到达南昌后，就包下了这个旅社。
28日，周恩来会见贺龙，把党中央和前敌委员会的起义决定和计划如实相告。贺龙当即表示：“我完全听党的指挥，党说怎么办，我就怎么办。”“无论南昌暴动成功还是失败，我都干！失败了，我就上山。”《南昌起义资料》，人民出版社1979年版，第2页。
为保证起义行动的万无一失，前敌委员会根据军情，又将起义时间推至8月1日凌晨4点。起义军规定的口令是“河山统一”。起义军的识别标志是颈上系红色领带，左臂扎白色毛巾，举事中使用的所有手电、马灯都贴上红色十字。
7月31日下午4点刚过，贺龙就把营以上军官都找来开会。贺龙领的是一个军，是这次起义的“大户”。会上，性格豪爽的他开门见山地向部下讲了4点：一是国民党已叛变了革命，国民党已经死了；二是只有跟着共产党走，中国才有希望；三是党已经决心领导武装暴动，解放人民；四是我已下决心跟共产党走了，愿意跟党走的可以留下继续革命，不愿意的也可以走。结果，第二十军中所有的军官都留了下来。
到了夜晚，为了麻痹国民党驻南昌的军队，朱德出面设宴邀请国民党部分团级以上军官喝酒打麻将，以此拖住他们。这是起义计划当中的一部分内容。当时驻南昌的国民党军官大多是朱德的老同事、老同学，许多还是他的老部下，所以大家毫不生疑欣然前往，“尽情消遣”。
但是，世上没有不透风的墙。在南昌这个各派势力交相并存的地方，起义的风声还是走漏了一星半点。为了保证起义的成功，前敌委员会临时决定把起义时间提前两个小时，即凌晨2点。然而，事实上，早于这个时间，起义的枪声就迫不及待地打响了。
起义开始后，在周恩来、贺龙、叶挺、朱德、刘伯承的领导下，按照作战计划，第二十军第一、二师向旧藩台衙门、大士院街、牛行车站等处守军发起进攻。这里的战斗最为激烈，因为敌方一个精锐警卫团事先得到叛徒副营长赵福生的告密，早有戒备。当第二十军第一、二师发起进攻时，敌人依托有利地形地物，以猛烈的火力封锁鼓楼洞口，致使起义军进展不利。贺龙闻讯，急令三、五两团增援，几经拼搏，终于全歼守敌。第十一军第二十四师向松柏巷天主教堂、新营房、百花洲等处守军发起进攻。在顺化门外，第二十军教导团、第六团和第十一军的第十师，对小营房和老营房的敌第九军所部发起猛攻，迅速解决了战斗。在新营房，第二十四师一部与广东农民武装并肩作战，敌人从睡梦中惊醒，还来不及摸到枪，就当了俘虏。
总之，由于敌弱我强，而且大部分敌军没有准备，所以，南昌城内的战斗进行得相当顺利。激战至拂晓，大约3个小时，全歼守军3000余人，缴获各种枪5000余支（挺），子弹70余万发，大炮数门。
当清晨来临，南昌市民打开关闭一夜的门窗，发现阳光下的南昌城已经是一个崭新的世界。红旗猎猎，军歌嘹亮，脖子上佩戴着红色领带的士兵活跃在大街小巷。
当日下午，驻马回岭的第二十五师第七十三团全部、第七十五团3个营和第七十四团机枪连，在聂荣臻、周士第率领下起义，8月2日到达南昌集中。聂荣臻曾回忆这个激动人心的经历：
8月1日这天下午，从南昌发来一列火车。我们知道南昌行动了，很高兴。好在事先给同志们打过招呼，做过准备，所以，一旦行动，忙而不乱。我和周士第同志商量后，决定立即将辎重装火车运走，部队随后向德安集中。……总指挥张发奎带着第二十五师师长张汉魂和他们的警卫营,乘火车追上来了。张发奎站在车门口喊:“你们干什么？要停止行动!”我同他之间只隔着一座铁路桥,看得清清楚楚,我命令战士鸣枪阻击,张发奎见势不妙,就慌里慌张地跳下车跑了，跟他一块跳车的还有李汉魂等几个人。由于跑得慌忙,张发奎的卫队,还有一些东西,都丢在车上,全部被我们俘获……整个行动是成功的,差不多有组织的部队都拉了出来。《聂荣臻回忆录》（上册），解放军出版社1984年版，第63-65页。
为了争取和团结国民党中一部分愿意继续革命的人士，起义成功后，中共前委按照中共中央关于这次起义仍用国民党左派名义号召革命的指示精神，以宋庆龄等人的名义发表了《中央委员宣言》。《宣言》揭露蒋介石、汪精卫背叛革命，弃毁孙中山“三大政策”的种种罪行，表达了继承孙中山遗志，“继续为反帝国主义与实行解决土地问题奋斗”的决心。8月1日上午，召开了有国民党中央委员、各省区特别市和海外党部代表参加的联席会议，成立了中国国民党革命委员会，推举邓演达、宋庆龄、何香凝、谭平山、吴玉章、贺龙、林祖涵（伯渠）、叶挺、周恩来、张国焘、李立三、恽代英、徐特立、彭湃、郭沫若等25人为委员。革命委员会任命吴玉章为秘书长，任命周恩来、贺龙、叶挺、刘伯承等组成参谋团，作为军事指挥机关，刘伯承为参谋团参谋长，郭沫若为总政治部主任。起义军仍沿用国民革命军第二方面军番号，贺龙兼代方面军总指挥，叶挺兼代方面军前敌总指挥。下辖第九、第十一和第二十共三个军。第九军，朱德任军长、朱克靖任党代表。第十一军，叶挺任军长、聂荣臻任党代表；第二十军，贺龙任军长、廖乾吾任党代表。全军共2万余人。
8月2日，南昌市各界群众数万人集会，庆祝南昌起义的伟大胜利和革命委员会的成立。会后各界青年踊跃参军，仅报名的学生就有数百人。
南昌起义后，汪精卫急令张发奎、朱培德等部向南昌进攻。8月3日起，中共前委按照中共中央原定计划，指挥起义军分批撤出南昌，沿抚河南下，计划经瑞金、寻邬(今寻乌)进入广东省，先攻占东江地区，发展革命力量，争取外援，而后再攻取广州。但是，当起义军行抵江西进贤县时，在起义时就表现动摇的第十一军第十师师长蔡廷锴驱逐在该师工作的共产党员，脱离了起义军，率部折向赣东北。加上酷暑远征，士兵逃跑和生病的不少，7日到达临川时，总兵力已减少到约13万人。
应该说南昌起义部队进军广东是一个错误的计划。当时，国民革命军大部分已经随蒋、汪转到反革命方面，坚持革命的仅仅是极少部分。在敌我力量相差悬殊的情势下，起义军应就近深入江西、湖南、湖北一带农村，结合当时还没有完全被反动势力镇压下去的农民运动。这样不仅能保存实力，而且还能在领导农民革命斗争中壮大力量。但是，没有足够革命实践经验的中共领导人，受苏俄革命模式——攻占大城市的影响，以城市为目标，忽视广大的农村，结果劳师远征，陷于不利境地。
起义军在临川休息3天，继续南进。8月，驻广东的国民党军第八路军总指挥李济深，调钱大钧部9000人，由赣州进至会昌、瑞金地区，阻止起义军南下；调黄绍竑部9000人由南雄、大庾(今大余)向雩都(今于都)前进，支援钱大钧部作战。起义军英勇奋战，先在壬田、后在会昌相继击破敌人的堵截，但付出了伤亡2000人的代价。
会昌战斗后，起义军折返瑞金改道东进，经福建长汀攻占广东大埔县三河坝，第十一军第二十五师留守，主力继续向南，准备占领广东潮、汕地区。
9月，起义军攻下潮、汕，经揭阳继续向汤坑(今丰顺市)推进，途中，不断遇到强敌的阻挠。至30日，起义军伤亡2000余人，无力再战，遂向揭阳撤退。10月3日，起义军主力在流沙(今普宁市)与由潮、汕撤出的革命委员会会合，继续向海丰、陆丰地区撤退，途中再次遭到敌军的截击，激战不胜，部队大部溃散。革命委员会和起义军领导人分散转移，余部1300余人进入海、陆丰地区。驻守三河坝的第二十五师最后仅余800人，在朱德、陈毅率领下，转战闽粤赣湘边，后参加了湘南起义，并于1928年4月到达井冈山革命根据地同毛泽东领导的湘赣边界秋收起义部队会合。
南昌起义是中国共产党直接领导的带有全局意义的一次武装暴动。它打响了武装反抗国民党反动统治的第一枪，表明了中国共产党把中国革命进行到底的坚定立场，标志着中国共产党独立创建革命军队和领导革命战争的开始。1933年7月11日，中华苏维埃共和国临时中央政府根据中央革命军事委员会6月30日的建议，决定8月1日为中国工农红军成立纪念日。从此，8月1日成为中国工农红军和后来的中国人民解放军的建军节。
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