赴重庆开展国统区工作
1940年3月，国民党特务在成都制造“抢米事件”，然后栽赃造谣说共产党策划饥民抢米，借此大肆逮捕成都地区的共产党员和进步人士。面对骤然恶化的时局，周恩来于5月10日率孔原、徐冰等一批干部分乘4辆卡车离开延安赴重庆。
到重庆后，周恩来立即约见再次离开新四军已在重庆的叶挺。他在和叶剑英、袁国平一同会见叶挺时，对叶挺说：“你是我们新四军的军长，负有指挥新四军全军军事工作的重大责任，中共中央信任你，相信你的军事才能和为人，也相信你对革命事业的忠诚。你离开新四军以后，蒋介石放出风声说新四军问题须重新解决，有派他人充任军长之意，这样于抗战与民主事业很不利。希望你能回到皖南军部去，带领这支革命队伍多打些胜仗，为中国人民的解放事业做出更大的贡献。你同项英的关系问题，项英应负主要责任，请相信党中央和我会负责解决好。”听了周恩来亲切真诚的谈话，叶挺深受感动，当即表示将尽快告诉蒋介石愿意回到新四军去。
6月初，周恩来会见蒋介石。他对蒋介石说：“中共诚意抗战并拥护委员长，而国民党却在抗战中实行反共、溶共、剿共政策，这只能帮助敌伪。所谓中共要举行暴动推翻国民党，完全是造谣。中共是要发展的，但主要是在敌占区同敌伪争取群众。中共诚意希望合作到底，而有人却想分裂，准备投降。”蒋介石听后说：“抗战团结都是有决心的，任何困难决不畏惧，国共间的一切问题都可以解决，但军事上必须服从命令。”周恩来说：“这要从两方面看，一方面服从，另一方面不应拿命令来胁迫。”蒋介石推托说：“这已是过去的事了。”最后，蒋介石表示国共关系可以商谈。
接着，周恩来同国民政府军事委员会参谋总长何应钦、副参谋总长白崇禧就陕甘宁边区问题、军队的编制问题和划分作战区域问题进行多次商谈。因为国民党方面拒绝了中国共产党提出的各项要求，谈判陷入僵持状态。
自6月14日起，周恩来连续主持南方局会议，听取南方局机关、《新华日报》以及各省、特委主要负责人的汇报，研究讨论今后的工作。他要求一切在国统区的我党各级组织必须从组织上、领导方式上以及活动方法上来一个大的转变，完全转变为秘密的地下党。《新华日报》和办事处也应改变工作方法和斗争方式，一切公开活动必须与地下党分开，以便能在恶劣环境下保存精干力量，继续展开党的各项工作。
9月27日，德、意、日在柏林签订协定，正式结成三国同盟。在这前后，英、美也签订了协定。这两大集团都在争取蒋介石，使得蒋介石踌躇满志，把这一国际形势看成是进行政治投机、大举反共的大好时机。
10月19日（皓日），在蒋介石的授意下，何应钦、白崇禧致电（史称“皓电”）朱德、彭德怀和叶挺，诬蔑坚持华中抗战的新四军和八路军“破坏团结，破坏抗战”，以最后通牒的形式，限黄河以南的新四军和八路军各部于电到1月内全部撤至黄河以北，妄图实现其沿河封锁、配合日寇消灭我军的毒辣阴谋。同时，蒋介石密令汤恩伯、李品仙、韩德勤等部30万大军及顾祝同所部，准备向华中大举进攻。至此，反共乌云弥漫全国，投降、内战的危险空前严重起来。
何应钦、白崇禧“皓电”最初是发到八路军参谋长叶剑英手里，要求转发给朱德、彭德怀、叶挺。叶剑英接到电报后，立即与周恩来商谈对策。接着，周恩来把秘书童小鹏找去，让他立刻把这份电文发回延安。
周恩来和南方局的领导同志分析了当时的形势，向中央提出了对付国民党阴谋的重要策略和意见。10月24日，周恩来电告毛泽东：“……汤恩伯、李铁军与马鸿逵等纷纷来渝，江南北部队亦在调动，对于华北进步报章之限制，对舆论反共之动员，对凡有共党左倾嫌疑者之加紧监视和逮捕，均证明反共高潮是正在著著上升”，“何、白19日电是表示了国方决心”。
10月25日，毛泽东一天内接连两次急电周恩来，指出：尽管蒋介石现在仍是动摇的，全面反共的决心也不容易下，“但我们应估计到最困难、最危险、最黑暗的可能性，并把这种情况当作一切布置的出发点，而不是把乐观情况作出发点”。
11月1日，周恩来致电中共中央，同意毛泽东的分析，并且断言：“破裂的危机已至”，“反共局部战争会开始”。当天，他在另一个电报中反映了反共高潮中的各方意见：“大家一致望我们拿出办法来，并望我们让步，以缓和破裂。”他还转达了冯玉祥的建议：“要软硬两用，表面让步，实际自干。”同时，建议中央：“用朱（德）、彭（德怀）、叶（挺）、项（英）名义通电答复何、白”，表示皖南新四军在有充分保障的条件下，可以移到江北，但要保证在移动中不许友军袭击。
第二天，毛泽东致电周恩来说：“今日会议，讨论你东日（1日）来电，仍主表面和缓，实际抵抗。”3日，他又致电周恩来，说明中共中央的政策是“一面极力争取好转避免内战，一面准备应付投降应付内战，而把重点放在应付投降应付内战方面，方不吃亏，方不上蒋的当。立即准备对付黑暗局面，这是全党的中心任务。有了这一着，就不会重蹈陈独秀的覆辙了”。
当日，朱德正在三五九旅视察。突然，旅长王震将毛泽东的急电交给朱德，电文为：“有事待商，拟派汽车来接，请准备回延。”于是，朱德中断视察，急匆匆地赶回延安，毛泽东同其他中央领导正在焦急不安地等待着。原来，这时离何、白“皓电”规定的新四军和八路军北撤时间只有十几天了，现在急迫需要朱德回延安商议的就是新四军北撤问题。
如何回答“皓电”，涉及对整个形势的估量和斗争的策略。经过中共中央认真研究后，接受了周恩来的有关意见，以朱、彭、叶、项的名义在11月9日（佳日）复电何应钦、白崇禧，驳斥他们在“皓电”中的无理命令和对共产党、八路军、新四军的攻击，尖锐地指出：“国内一部分人士，复正在策动所谓新的反共高潮，企图为投降肃清道路。内外勾煽，欲以所谓中日联合剿共，结束抗战局面，以内战代抗战，以投降代独立，以分裂代团结，以黑暗代光明。其事至险，其计至毒，道路相告，动魄惊心，时局危机，诚未有如今日之甚者。”为了顾全大局，朱德等在复电中仍表示新四军在江南的正规部队将遵令北移。
为了使世人进一步了解事实真相，周恩来通过各种渠道对社会各界进行大量的解释工作，向他们阐明中国共产党关于团结抗日的基本立场，揭露国民党制造摩擦、破坏国共合作的真实情况，以争取他们的同情。那些日子，周恩来总是行色匆匆，时而奔赴市区，时而返回红岩，他多次同黄炎培、沈钧儒、章伯钧、邹韬奋、张申府、梁漱溟、张君劢、左舜生等集会商谈时局，说明实际情况。当时，美国作家斯特朗从苏联回国，途经重庆。周恩来同她长谈了几个晚上，详细地介绍国民党两年来制造反共摩擦事件的真相及八路军、新四军的历史和现状，并预言更大的反共事变将接踵而至。谈话结束时，周恩来嘱咐斯特朗：“这些材料暂时不要发表，等我捎信给你，同意你这样做时再发表。”同时，周恩来还指示南方局除组织口头解释外，还编印传单、小册子（内容包括半年来国共双方来往文电和国民党反共文件等），秘密运到八路军驻桂林办事处和西安办事处向社会各界广泛散发。
与此同时，周恩来继续代表中共中央同国民党谈判新四军北移问题，表示只要严重事件还没有发生，他仍要尽最大的努力争取使问题得到和平解决。他和叶剑英同国民党代表刘斐、张冲举行多次会谈，要求国民党停止在陕北、皖北和苏北的军事行动，表明中国共产党的让步是有限度的，警告国民党如不停止进攻就应负国共破裂的责任。
“佳电”发出后，蒋介石不但置若罔闻，反视中共委曲求全的让步为怯弱可欺。12月8日（齐日），竟又以何应钦、白崇禧名义再次电令：在12月31日前，长江以南之新四军全部开到长江以北，黄河以南之八路军全部开到黄河以北，1941年1月底之前，华中之新四军也要全部开到黄河以北。蒋一面限令我军转移，一面又秘密下达了“剿灭黄河以南匪军计划”和“解决江南新四军方案”，并密令顾祝同积极部署包围进攻我皖南部队。
12月25日，圣诞节，这一天正是蒋介石在西安事变中获释第4周年。周恩来应邀往见蒋介石。一见面，一向沉默寡言的蒋介石紧握周恩来的手显得有些激动：“连日来琐事甚多，情绪不好，本不想见，但因为今天是4年前共患难的日子，故以得见面谈话为好。”他越说越动感情，掏出手绢擦起眼睛来：“抗战4年，现在是有利时机，胜利已有希望，我难道愿意内战吗？愿意弄坍台吗？现在八路、新四还不都是我的部下？我为什么要自相残杀？就是民国十六年，我们何尝不觉得痛心？内战时，一面在打，一面也很难过。”
随后，蒋介石话锋一转，露出威胁的口吻：“你们如果非留在江北免调不可，大家都是革命的，冲突决难避免，我敢断言你们必失败。如能调到河北，你们做法一定会影响全国，将来必成功。”周恩来说：“我们已经顾全大局，将江南正规部队遵令北移，对于江北部队还是拟请免调。”蒋介石用缓和的语气说：“只要你说出一条北上的路，我可担保绝对不会妨碍你们通过。只要你们肯开过河北，我担保至1月底，绝不进兵。”蒋说，至于“政治问题，都好解决”。
次日，周恩来向中共中央报告了蒋介石谈话的内容，并冷静地指出：蒋的许多承诺是“靠不住”的，“其实局部‘剿共’仍在加紧布置中”。
1941年1月4日，新四军军部和所属皖南部队9000余人，为顾全团结抗战大局，在军长叶挺、副军长项英率领下，从皖南泾县云岭及其附近地区冒雨出发，准备绕道茂林、三溪、宁国、郎溪，到江苏省溧阳待机渡江北移。6日，行经安徽泾县茂林地区时，突然遭到国民党军队顾祝同、上官云相部7个师8万多人的层层堵截和进攻。朱德果断命令：“甩开敌人，不必恋战，迅速过江！”但为时已晚。
“长江、长江，我是黄河、黄河！”电报在空中呼叫着，但对方没有回音。9000多名将士落入了国民党军的包围之中。这就是震惊中外的皖南事变。
“为江南死国难者志哀”
1月11日，是《新华日报》创刊3周年纪念日。晚上，报社举行晚会。周恩来走上讲台做报告，大家都怀着激动的心情倾听。这时，红岩八路军办事处的两个机要人员满头大汗快步走进会场，把一封标有AAAA符号的特急电报交给周恩来。周恩来拿着电文的手在微微颤抖，目光急速扫视电文内容，立即以愤怒和沉痛的心情向全体同志宣布，我新四军军部在皖南遭到国民党反动派的围歼，伤亡惨重，局势危急……
这时，饭厅里的电灯突然熄灭，四周一片漆黑。大家以为是国民党特务来捣乱，都在为周恩来的安全担心。可是，他坚定沉着，意味深长地激励大家说：“同志们，黑暗是暂时的，光明一定会到来！有革命斗争经验的人，都懂得怎样在光明和黑暗中奋斗，不但遇着光明不骄傲，更主要是遇见黑暗不灰心丧气。只要大家坚持信念，不顾艰难向前奋斗，并且在黑暗中显示英勇卓绝的战斗精神，胜利是要到来的，黑暗是必然被冲破的。”电灯又亮了，周恩来继续说：“皖南事变是反动派破坏抗战、破坏团结的重大阴谋，我们不要被反动派的阴谋吓倒，要坚决粉碎他们的进攻。”最后他提醒大家：“国民党反动派对我们的迫害，还只是其分裂投降阴谋的开始，我们要准备迎接更严重、更艰巨的斗争。”
周恩来讲完话后，立即着手布置工作。他首先指示《新华日报》社的负责同志第二天在报上将国民党袭击新四军的阴谋透露出去。随后，连夜召开南方局紧急会议，研究事变发生后的局势和斗争方针，并向中央请示报告。直到深夜，他还给张冲写信，向国民党提出严重抗议并要求张冲速报蒋介石，制止皖南国民党军队对新四军的围歼暴行，尽速撤围让路。他在信中说：“否则新四军渡江无路，后退无援，只有突围四出，散于民间，战于敌后，以求生存。”
当时，朱德与彭德怀、叶挺、项英联名发表通电，向全国揭露皖南事变真相，要求国民党军事当局“立解皖南大军之包围，开放挺等北上之道路。撤退华中之剿共军，平毁西北之封锁线，停止全国之屠杀，制止黑暗之反动，以挽危局，以全国命”。
新四军指战员在叶挺的指挥下，被迫奋起自卫，浴血苦战7昼夜，到1月14日，终因寡不敌众，弹尽粮绝，除约2000人分散突出重围外，其余分别被打散、被俘或牺牲。朱德闻之全军将士惨败，数天水米难咽，欲哭无泪。
叶挺根据中共中央东南局副书记饶漱石的意见，14日下午走出隐蔽处准备同国民党军谈判，竟被扣押。政治部主任袁国平在突围时牺牲。副军长项英和副参谋长周子昆在泾县濂坑石牛坞赤坑山的蜜蜂洞隐蔽，后遭叛徒杀害。朱德得到噩耗，悲痛切齿：“失我民心失天下，夺我将士夺良才！”
在这些日子里，周恩来宵衣旰食，经常通宵达旦地工作，曾经连续3昼夜没有安枕。他一方面同国民党进行坚决斗争，一方面通知地下党采取应急措施，保护党员和进步分子的安全。
1月17日晚，国民党政府军事委员会通过中央通讯社发布通令，反诬新四军“叛变”，悍然撤销新四军番号，声称要把叶挺“交军法审判”。
周恩来在曾家岩50号获悉这一情况后，义愤填膺，立刻打电话给何应钦，痛斥：“你们的行为是亲者痛，仇者快，你们做了日寇想做而做不到的事……你何应钦是中华民族的千古罪人！”说完，愤愤地摔了电话听筒。随即驱车到张冲处，当面提出质问和抗议，再返回到红岩。
周恩来回到红岩后，夜已很深了。八路军办事处的全体党员除了担任警戒和电台值班的外，都集合在二楼的过道等待他。周恩来上楼后，站在过道的正当中，沉默了片刻，就开始报告新四军军部遭受围歼的经过。他沉痛又悲愤的声音，激起同志们对国民党反动派的无限仇恨。当周恩来讲到国民党诬蔑新四军为“叛军”，取消新四军的番号的反动命令，他愤慨地指出：“顽固派的阴谋，就是要消灭共产党，消灭八路军、新四军。”
周恩来的讲话由悲愤的控诉，转变为清醒的分析：“时局的发展有两种可能，国共两党藕断丝连的局面既有可能继续维持下去，也有可能一刀两断，全面破裂。我们要有充分的准备，要准备反动派突然袭击，要准备被捕、坐牢、砍头！不管怎样，我和同志们在一起！”
周恩来炯炯的眼神扫视着会场，在现场的邓颖超分明感受到他内心的激动和坚定，她以同样坚定的眼光迎接着他无畏的目光，似乎告诉他：“恩来，你放心，无论被捕、坐牢、杀头，我总会和你在一起！”她的目光迅速巡视会场，她看到同志们的目光中，分明也在无声地呼喊：“周副主席，我们会永远和你在一起！”
周恩来谈到，反动派突然袭击的可能性最大，主要想攫取我们党的机密，破坏地下党组织，迫害同情我们的爱国民主人士。说到这里，他举目扫视大家，接着说：“如果发生这种情况，我要去同蒋介石交涉。我是蒋介石、国民党请来的，一定要尽可能争取让蒋把我们送回延安，争取全师而归。如果我们被抓起来，要坚持不泄露党的机密。如问你们是不是共产党员，男同志都承认是共产党员，女同志承认是家属，因为我们是公开的共产党机关。问你们党的组织情况，可以告诉反动派，我们的中央在延安，主席是毛泽东。红岩和曾家岩有一个支部，支委是周恩来、董必武、邓颖超，书记就是周恩来。问别的，你们一概不知，可以叫他们去问支部书记，问周恩来，问我！”大家纷纷表示：“周副主席，请放心。我们一定沉着应变！”
这时，《新华日报》的同志来向周恩来汇报说：“《新华日报》写的关于皖南事变真相的报道和评论文章，被国民党的新闻检查所全部扣压，禁止刊登。新闻检查所的人仍不放心，还在报社坐等要看第二天的报纸。”周恩来听后略有所思，说：“你回去告诉章汉夫（《新华日报》总编辑），把被检扣的两个地方用别的消息补上，印好几张报纸送检查。我要另写东西放在那两个地方，不送检，大量印发。除报丁报童外，动员工作人员出去散发。”
随后，周恩来愤然挥笔：“千古奇冤，江南一叶；同室操戈，相煎何急？”思忖片刻，又写下“为江南死国难者志哀”。此时已经是18日凌晨了，周恩来把题词装上信封，写好“立送汉夫同志亲收”交给童小鹏，并要他把办事处副官岳仁和叫起来，要警卫班派一人同他一起把这封信送交章汉夫。
章汉夫收到后，立即按周恩来指示办，连夜准备了两种内容不同的版面，一种是刊载周恩来题词手迹的，一种是专门为对付检查而安排的。把后者先印好几张后即送检查官看，他们以为没有问题了，就走了。
黎明前，印有周恩来手迹的报纸印好了，报社的同志和勇敢的报童把报纸包在铺盖卷里，装在箩筐里，从报社的后山偷运进城，送到广大的读者手中。当国民党顽固派发觉市面上出现印有周恩来亲笔题词的《新华日报》时，大批的报纸已经冲破国民党军、警、宪、特的封锁，传遍了山城的大街小巷。
当天，新闻检查所长回到上清寺国民党中央宣传部，向部长潘公展汇报他在《新华日报》的得意情形，呈上拿回的几张没有题词的报纸时，大家面带笑容，满以为他们监视《新华日报》的目的达到了。正要回家休息时，有人送来街上叫卖的有周恩来题词的报纸，潘公展看了脸色发青，怒斥那位检查所长是个大草包，慌忙要人赶快禁止再卖《新华日报》。
国民党当局下令搜查报纸，逮捕报童、报丁。周恩来知道后，又亲自找张冲一起到警备司令部交涉放人和要回被扣的报纸，并气愤地对国民党官员说：“如果不放人，那我和董必武等自己上街卖报。”迫使国民党当局放回被扣的人。
为了使社会上明了事实真相，叶剑英于1月19日领导军事组起草了《新四军皖南部队惨被围歼真相》，经周恩来核准后交《新华日报》社印成单张，通过各种渠道散发重庆和各地党政军民机关团体以及外国友人。
当时，中共中央十分担心周恩来和南方局其他重要成员的安全，两次来电要求“恩来、剑英、必武、颖超及办事处、报馆重要干部于最短期间离渝”。南方局在周恩来的房间里召开了一个人数不多的会议，讨论中央这一指示。周恩来断然说：“我要坚持到最后！”邓颖超毅然决然地说：“这样严重复杂的局势，恩来怎能离开。”她表示，她也将“坚持到最后”。叶剑英、董必武也是这个态度。会议最后商定：周恩来等少数人留在重庆，坚持斗争，其余同志转移或撤退回延安。
他把会议结果电告中央，但中央担心他的安全，仍来电催促尽快回去。经周恩来反复陈说，中央最后同意周恩来、董必武、邓颖超等留在重庆，叶剑英率蒋南翔、李涛、边章五等撤回延安。
当最后一批撤回延安的同志离渝时，行前的一个晚上，周恩来细致地审查了全部准备工作，叮嘱廖似光等：“要保证安全到达延安。每个人都要严格遵守纪律。每到一个站停车时，不允许有一个人单独行动。到检查站时，由车队的副官去应付。遇到刁难时，副官交涉还不成，廖似光你可以以少将身份出来交涉。每过一个检查站，都要来信告知。到达延安，即来电报。”他嘱咐完已是深夜，又对廖似光说：“明早走之前再来一下。”第二天上车前，廖似光轻轻走到他门口，但心里还有点犹豫，怕影响他休息。周恩来已听到她的脚步声，叫道：“似光进来呀！”进去后，周恩来紧握着她的手说：“你回到延安，转告毛主席，我们坚决同国民党顽固派斗争到底！”廖似光不禁眼泪夺眶而出，哽咽着说：“一定遵嘱办理，请副主席多多保重！”由于计划周密，转移出去的人员都安全到达目的地。
对留下来坚守岗位的人员，周恩来对他们进行了严格的气节教育和保密教育。他指定童小鹏、袁超俊等成立一个秘密工作委员会，准备对付国民党的突然袭击，严格要求：各部门清理机密文件，有些重要档案用密电发往延安，发完后全部焚毁，必须保存的密码写在薄纸上，随时准备销毁；机关内部装置报警设备和石灰包、沙包，以便在遇到突然袭击时，可以一面抵抗，一面发出警报，争取时间，及时烧毁文件……
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